Mejora de la supervivencia y aptitud tecnológica de cepas industriales de Lactococcus. lactis mediante evolución adaptativa

Zusammenfassung

Lactococcus lactis es el componente mayoritario de los cultivos iniciadores mesófilos utilizados en la elaboración de productos lácteos fermentados. El éxito de una fermentación industrial depende en gran medida de la viabilidad y actividad metabólica de los cultivos microbianos utilizados. Por tanto, para mejorar la competitividad y optimizar el uso de nuestros recursos microbianos, se demandan cepas robustas que resistan las condiciones adversas, inherentes a estos procesos industriales. Durante el proceso fermentativo, L. lactis debe enfrentarse a diferentes condiciones de estrés que, en muchas ocasiones, tienen un impacto sobre la pared celular, una estructura celular esencial por lo que su integridad es un factor determinante para garantizar la viabilidad. De hecho, resultados previos a esta Tesis Doctoral habían demostrado que la modulación de la pared celular en cepas de laboratorio de L. lactis daba lugar a cepas más robustas y resistentes a condiciones de estrés tecnológico. Estos resultados, unidos a la creciente demanda de productos fermentados con características organolépticas distintivas, han propiciado la búsqueda de nuevas estrategias para aumentar la diversidad de los cultivos iniciadores disponibles que sean robustos y que presenten nuevos fenotipos y funcionalidades. En este contexto se ha desarrollado el trabajo de esta Tesis Doctoral fundamentado en la aplicación de la evolución adaptativa bajo condiciones de estrés sobre la pared celular, EA-CES, como estrategia para diversificar y mejorar la aptitud tecnológica de L. lactis usando la bacteriocina Lcn972 como agente selectivo. El proceso de EA-CES se aplicó a tres cepas acidificantes de L. lactis y cinco cepas productoras de nisina, una de ellas comercializada como cultivo protector. Se desarrolló en dos pasos: uno de adaptación, que implicó realizar cultivos en presencia de concentraciones crecientes de Lcn972 para seleccionar mutantes resistentes Lcn972R, y otro de estabilización, que conllevó pases sucesivos en ausencia de presión selectiva, sin Lcn972, para fijar mutaciones que no interfiriesen negativamente con el crecimiento. Se obtuvieron mutantes estables y resistentes a Lcn972 a partir de todas las cepas utilizadas. Salvo los mutantes derivados del cultivo protector, que perdieron el plásmido de la lactosa durante la adaptación a Lcn972, todos los demás mantuvieron los mismos parámetros de crecimiento en condiciones de laboratorio, así como la misma tasa de acidificación en leche. Por el contrario, sí se detectaron cambios significativos en las propiedades de superficie (hidrofobicidad), siendo algunos mutantes Lcn972R más hidrófobos que su cepa parental, en el grado de autolisis, que en algunos casos fue mayor que en las cepas de origen, resistencia a estrés oxidativo, al tratamiento térmico y/o a otros antimicrobianos de pared (lisozima, bacitracina y nisina). El perfil de susceptibilidad a la infección por bacteriófagos solo se vio alterado en tres cepas productoras de nisina, cuyos derivados Lcn972R fueron más sensibles a la infección. La producción de nisina tampoco se vio afectada, detectándose concentraciones similares tanto en medio de cultivo como en leche. Por otro lado, mediante el análisis genómico preliminar de los mutantes Lcn972R se detectaron mutaciones puntuales en genes implicados mayoritariamente en 3 categorías funcionales: reguladores transcripcionales, estrés/detoxificación y envuelta celular. Las mutaciones más frecuentes se detectaron en los genes que codifican un módulo de detección y detoxificación de tipo Bce, YsaDCB/TCS-G, no caracterizado previamente en L. lactis. Los resultados mostraron que el transportador YsaDCB estaba implicado en la resistencia de L. lactis a la Lcn972 y a la bacitracina. También se demostró que las mutaciones seleccionadas presentes en el gen ysaB, que codifica para la permeasa del transportador, provocaban la activación constitutiva del sistema de dos componentes asociado TCS-G. La obtención de diferentes fenotipos, tanto entre mutantes derivados de la misma cepa de partida como derivados de distintas cepas, confirma la plasticidad de L. lactis en su adaptación al estrés sobre la pared celular y avala el uso de la EA-CES para generar diversidad funcional en L. lactis sin hacer uso de la tecnología del ADN recombinante