Biofilm formation by microorganisms of interest in food industriesintraspecies variability, biomarkers and control strategies based on non-thermal atmospheric plasma technologies

Resum

Las comunidades microbianas que colonizan los ambientes de procesado de alimentos en forma de biopelículas tienen un gran impacto en la calidad y seguridad de los alimentos. Por lo tanto, el estudio de los factores que influyen en la formación, la ecología y la arquitectura de las biopelículas de microorganismos patógenos y alterantes es clave para el desarrollo de nuevas estrategias de control o eliminación de biopelículas. En la presente Tesis Doctoral se examinó la variabilidad intraespecífica en cuanto a la capacidad de formación de biopelículas y otras características fenotípicas en una amplia colección de aislados de varios microorganismos de interés en la industria alimentaria. La importancia del regulador general de la respuesta a estrés de las bacterias Gram negativas, RpoS, en la formación de biopelículas se evaluó en nueve aislados de Cronobacter sakazakii. Su capacidad de formación de biopelículas se evaluó en BHI y medios mínimos con diferentes valores de pH y suplementados o no con los aminoácidos arginina, lisina y ácido glutámico, resultando ésta generalmente mayor en medios mínimos tamponados (pH 7,0) suplementados con lisina, a pesar de la heterogeneidad existente entre las diferentes cepas. La formación de biopelículas se visualizó mediante microscopía de barrido láser confocal y microscopía electrónica de barrido y se midió mediante determinación espectrométrica del cristal violeta fijado, mostrando niveles más altos de formación de biopelículas sobre acero inoxidable que sobre poliestireno. Se pudo apreciar una menor capacidad para formar biopelículas en una cepa con una mutación que resulta en la pérdida de función del gen rpoS, en comparación con el resto de las cepas estudiadas, que portan un gen rpoS funcional. La complementación de esta cepa con un gen rpoS funcional aumentó su capacidad de formación de biopelículas hasta niveles similares a los de las cepas con un gen rpoS funcional después de 24 h de incubación. Las diferencias observadas se redujeron cuando se utilizó una incubación de 48 h. Estos resultados indican que la pérdida del factor RpoS provoca un retraso en el desarrollo de biopelículas maduras, pero no una inhibición completa de la producción de biopelículas en C. sakazakii. También se evaluó la funcionalidad del regulador RpoS y la capacidad de formación de biopelículas en una colección de treinta y una cepas de Escherichia coli productoras de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE), aisladas de alimentos de origen animal y de pacientes humanos, y cepas de colección de referencia, junto con su tolerancia a condiciones de estrés comunes en la cadena alimentaria (calor, ácido, plasma atmosférico no térmico (PANT) y luz UV-C). Solo se observaron diferencias menores asociadas a la presencia de los genes BLEE blaTEM, blaCTX-M y blaSHV, y no se encontraron mutaciones en el gen rpoS que conllevaran una pérdida de función. Las diferencias fenotípicas más relevantes se observaron para la formación de biopelículas y la resistencia al calor, siendo los aislados alimentarios significativamente más resistentes a los tratamientos térmicos a 58 oC durante 1 y 2 minutos que los aislados clínicos. Además, la capacidad de formación de biopelículas sobre acero inoxidable fue significativamente mayor para los aislados de campo, tanto de origen clínico como alimentario, que para las cepas de referencia. Asimismo, se caracterizó una colección de treinta y tres cepas de Pseudomonas spp. aisladas de instalaciones de procesado de alimentos en cuanto a la funcionalidad del regulador RpoS, la actividad catalasa, la pigmentación en medio sólido, la producción de pioverdina, la hidrofobicidad celular y la formación de biopelículas sobre acero inoxidable, poliestireno y vidrio, con el fin de encontrar biomarcadores de fuerte producción de biopelículas. Los niveles de formación de biopelículas sobre acero inoxidable y poliestireno fueron significativamente más altos para las cepas con pigmentación verde en comparación con las cepas marrones o no pigmentadas. Las posibles relaciones entre la producción de pioverdina, la pigmentación de las colonias y la disponibilidad de hierro se estudiaron utilizando un secuestrador de hierro, 2,2-bipiridina, que provocó una disminución del 40 % en la formación de biopelículas por parte de las cepas no pigmentadas. Para la mayoría de los posibles biomarcadores estudiados, la heterogeneidad fenotípica observada entre las cepas dependía principalmente de la asignación taxonómica de la cepa de Pseudomonas (P. aeruginosa frente a otras especies de Pseudomonas). Sin embargo, la pigmentación verde de las colonias en medio sólido se identificó como un posible biomarcador de fuerte formación de biopelículas. Durante esta Tesis Doctoral, se evaluaron dos estrategias de control de biopelículas basadas en la tecnología del plasma. La primera se centró en el desarrollo de recubrimientos anti-biopelícula que eviten la adherencia bacteriana a las superficies mediante modificaciones físico-químicas. Se aplicaron diferentes recubrimientos de (3 aminopropil)trietoxisilano (APTES), ortosilicato de tetraetilo (TEOS) y ácido acrílico (AA) mediante plasma atmosférico no equilibrado sobre acero inoxidable AISI 316. Se evaluó su actividad anti-biopelícula frente a biopelículas de L. monocytogenes CECT911 y E. coli CECT515 tras la incubación a 37 oC. Los dos mejores recubrimientos, AP10+TE6 y AP10+AA6, que redujeron la producción de biopelículas de L. monocytogenes en un 45 % y un 74 %, respectivamente, en comparación con el acero inoxidable sin recubrimiento, se seleccionaron para una caracterización más detallada junto con una modificación de esos recubrimientos, AP10+SA6. Se estudió la actividad anti-biopelícula frente a dos cepas de L. monocytogenes aisladas de una industria cárnica y a temperaturas de incubación más bajas, representativas de ambientes de procesado de alimentos, obteniendo los mejores resultados para el recubrimiento AP10+AA6, que redujo la formación de biopelículas en un 90 %. después de la incubación a 12 oC. La caracterización morfológica y físico-química de los recubrimientos seleccionados mostró que el recubrimiento más efectivo, AP10+AA6, presentaba una menor rugosidad superficial y mayor hidrofilicidad, característica que se vio favorecida por las condiciones de baja temperatura, cuando la humectabilidad de las cepas fue mayor. En conjunto, estos resultados sugieren la formación de una capa de hidratación que impide la adherencia de las células de L. monocytogenes a la superficie recubierta. Se continuó con la caracterización del recubrimiento AP10+AA6 estudiando su actividad anti-biopelícula frente a biopelículas multiespecies que contienen L. monocytogenes (desarrolladas a partir de la microbiota autóctona de tres industrias cárnicas diferentes) y evaluando la eficacia desinfectante y evolución de las biopelículas tras la higienización con dos biocidas empleados en la industria alimentaria, utilizando enfoques dependientes e independientes del cultivo. Se observó una menor efectividad del recubrimiento frente a L. monocytogenes en los biofilms multiespecie desarrollados durante 7 días a 12 oC, además de un control parcial, y dependiente de la industria, del crecimiento del patógeno. La composición taxonómica de la biopelícula dependió en gran medida de la industria, pero no se vio afectada por la naturaleza de la superficie (acero inoxidable sin revestimiento o con revestimiento) o por la inoculación artificial con L. monocytogenes. Las biopelículas formadas durante 7 días a 12 oC después de los tratamientos de desinfección de 15 min mostraron una menor diversidad taxonómica y el hipoclorito sódico, aunque fue ligeramente menos efectivo que el ácido peracético inmediatamente después de la aplicación, permitió un mejor control del crecimiento de L. monocytogenes en las biopelículas multiespecies desarrolladas. Esto sugiere que una desinfección capaz de preservar las relaciones competitivas interespecíficas entre los miembros de la microbiota autóctona y L. monocytogenes podría ser más favorable para el control a largo plazo de este patógeno en las instalaciones de procesado de alimentos. La segunda tecnología basada en plasma evaluada en la presente Tesis Doctoral fue el uso de agua activada por plasma (PAW) como estrategia de control alternativa para la inactivación de L. monocytogenes. Se generaron diferentes PAWs a través de la activación del agua del grifo utilizando un plasma de descarga de barrera dieléctrica superficial (SDBD) funcionando con diferentes condiciones de potencia de descarga (26 y 36 W) y tiempo de activación (5 y 30 min). El estudio de composición físico-química (pH y niveles de peróxido de hidrógeno, nitratos y nitritos) y eficacia antimicrobiana frente a un cóctel de tres cepas de L. monocytogenes en estado planctónico permitió identificar las mejores condiciones de generación de PAW, que fueron 36 W de potencia de descarga con 30 min de tiempo de activación (PAW HM30). La actividad antimicrobiana de esta PAW frente a biopelículas de L. monocytogenes fue menor que en estado planctónico, donde se lograron reducciones logarítmicas de 4,6, pero aun así se pudieron obtener reducciones logarítmicas de 1,9 y 1,8 después de 15 minutos de exposición para las biopelículas formadas en acero inoxidable y en poliestireno, respectivamente. Los mecanismos de inactivación del PAW se investigaron mediante el análisis por ARN-seq de L. monocytogenes después de su tratamiento con PAW HM30. Los principales cambios en la expresión génica afectaron el metabolismo del carbono, algunos genes de virulencia y la respuesta general al estrés, perteneciendo varios de los genes más sobreexpresados al cluster de genes dependientes de la cobalamina, previamente relacionado con la patogenicidad de L. monocytogenes y su respuesta a múltiples condiciones de estrés.